Иммуноглобулины үйлдвэрлэлд донорын k сийвэн болон хөлдөөсөн сийвэн ашигласан үр дүнгийн харьцуулсан судалгаа

Үндэслэл
Монгол улсад коронавирусын халдвар тархсантай холбоотойгоор Засгийн газрын 2021 оны 144 дүгээр тогтоолоор Нийгмийн эрүүл мэндийн үндэсний төвийн Биобэлдмэлийн үйлдвэрт коронавирусын эсрэг иммуноглобулиныг үйлдвэрлэх, тусламж үйлчилгээнд нэвтрүүлэх албан даалгаврыг өгсөн. Тус албан даалгаврын хэрэгжилттэй холбоотойгоор 2021 оны III улиралд багтаан эмнэлгийн коронавирусын эмчилгээний удирдамжинд иммуноглобулиныг хэрэглэх зааврыг батлуулсан.  
Иммуноглобулиныг томуу, томуу төст өвчин, вируст хепатит, улаан бурхан, стафилококк, менингококк зэрэг вирус бактерийн гаралтай халдвар, мэс заслын дараах цусан үжлийн хүндрэл, дархлалын тогтолцооны идэвхи буурсан үед эмчилгээний болон урьдчилан сэргийлэх зорилгоор хэрэглэдэг. 
Манай улсад иммуноглобулиныг 1980 оноос хойш үйлдвэрлэж эхлэсэн бөгөөд тухайн үеийн технологийн зааврын дагуу иммуноглобулиныг ихсийн цуснаас ялган авч үйлдвэрлэдэг байсан бол 2006-2008 оны Шинжлэх ухаан, технологийн сангийн хөрөнгө оруулалтаар гүйцэтгэсэн “Цус, цусны бүтээгдэхүүний аюулгүй байдлыг хангах, хүрэлцээтэй, тогтвортой хангамжийг бүрдүүлэх арга технологи” төслийн үр дүнд иммуноглобулин үйлдвэрлэх технологийг сайжруулан донорын сийвэн ашиглан үйлдвэрлэх туршилт амжилттай хийгдсэн.  
Зорилго
Иммуноглобулины үйлдвэрлэлийг явуулахад К сийвэн болон хөлдөөсөн сийвэнг ашиглах харьцуулсан судалгааг гүйцэтгэх

Материал арга зүй
Эхлэл материал буюу түүхий эдээр К сийвэн болон хөлдөөсөн шинэ сийвэнг ашиглана. К сийвэн буюу криопреципитат нь хөлдөөсөн шинэ сийвэнг +40С-ын температурт аажим гэсгээн цус бүлэгнүүлэх уургийн тунадасыг цуглуулан авч, 10-20 мл сийвэн уусгасан бэлдмэл юм. Хөлдөөсөн шинэ сийвэн нь донороос цуглуулсан цуснаас 10 цагийн дотор ялгасан бүлэгнэлтийн тогтвортой, тогтворгүй хүчин зүйлсийг агуулсан бүтээгдэхүүн байна. Үйлдвэрлэлд ашиглах эдгээр түүхий эд нь дараах шаардлагыг хангасан байна (Хүснэгт 1). 
 
  

 
Шаардлага хангасан 92 л К сийвэн, 94 л хөлдөөсөн шинэ сийвэнг үйлдвэрлэлийн дараагийн шат дамжлага руу шилжүүлсэн.  
Түүхий эдийг Конны аргын дагуу 6 шатаар фракцлах буюу этанолоор тунадасжуулан, суперцентрфугийн тусламжтай супернатант болон тунадасны сепарацийг явуулна (Зураг 1).  Фракцын шат бүр температур, хугацаа, шингэний рН зэрэг нөхцөлүүдээрээ ялгаатай. Түүхий эд, фракцын шат дамжлага болон бэлэн бүтээгдэхүүнд иммунологи, микробиологи, биохимийн чанарын шинжилгээнүүдийг хийх ба гарган авсан бэлэн бүтээгдэхүүнийг туршилтын амьтанд тарьж, биологийн шинжилгээг гүйцэтгэнэ.  
1.    Иммунологийн шинжилгээгээр ФХУ-ын аргаар хепатит В, С вирусын эсрэг бие, ХДХВ, тэмбүүгийн өвчин үүсгэгч буюу Treponema pallidum-ийн эсрэгбие илрүүлнэ. Шинжилгээний арга зүйн харьцуулсан бүдүүвчийг Зураг 2-т харууллаа.
2.    Хими, биохимийн шинжилгээгээр рН, гемапигмент, нийт уураг, уургийн цэвэршилт давсны хэмжээ, прекалликрейн идэвхжүүлэгч тодорхойлно.

Нийт уургийн хэмжээ тодорхойлох: Сулруулсан дээж уусмалаас 2 мл авч 5 мл биуретийн урвалж нэмж, тасалгааны температурт 30 мин тавина. Уургийн стандарт уусмалыг 50 дахин шингэлж, 2 мл таслан авч 5 мл биуретийн урвалж нэмж, тасалгааны температурт 30 мин байлгана. Хяналтын сорилд 0.9% NaCl уусмалаас 2 мл авч 5 мл биуретийн урвалж нэмж мөн 30 мин байлгана. 30 мин болсны дараа 1 см зузаантай кюветэд хийж спектрофотометр (СФМ)-ийн 530 нм долгионы уртад хэмжилт хийнэ.

Гемапигмент тодорхойлох: 1 мл дээж авч, 9 мл нэрмэл усаар 10 дахин шингэрүүлнэ. 1 см зузаантай кювет ашиглаж СФМ-ийн 406 нм долгионы уртад хэмжилт хийнэ.
 

 
Натрийн хлоридын хэмжээг тодорхойлох: 1 мл дээж авч 5 дусал 2% K₂CrO₄ нэмж 0.1н
AgNO3 уусмалаар титрлэнэ. Урвалын эцэст улаан өнгө үүснэ.

Уургийн цэвэршилт тодорхойлох: Электрофорезийн аппаратын камерын нэмэх, хасах туйлын хундага тус бүрт 300-400 мл барбиталын буфер хийнэ. Хроматографын 25Ч4 хэмжээтэй цаасан дээр гарааны шугамыг хасах туйлаас 8.5-10.5 см зайтай балын харандаагаар мөр гаргаж, шинжлэх дээжнээс дусаагаад 250 вольтод 6 цаг электрофорез явуулна. Электрограммаа авч шилэн хавчаарт тогтоогоод, хатаах шүүгээнд босоо байдлаар 100-1100С-т 15 минут хатааж, будагч бодисоор 15-20 минут турш будаж, будгийг арилтал угаагчаар угаагаад тасалгааны температурт хатаасны дараа 0.01н NaOH элюци хийнэ. Элюцийг хийхдээ электрограммаа хамгийн тод үүссэн толбыг иммуноглобулины хэсэг, түүнээс дээш хэсгийг бусад уургийн хольцийн хэсэг, цаасны будагдаагүй хэсгээс хяналтын сорилыг авна.
 

30 мл 0.01н NaOH-д иммуноглобулины хэсгийг, 10 мл 0.01н NaOH-д бусад уургийн хольц болон хяналтын сорилын хэсгүүдийг уусгаад тасалгааны хэмд 30 мин тавина. 1 см зузаантай кювет ашиглан СФМ-ийн 620 нм долгионы уртад хэмжилт хийж, уургийн цэвэршилтийг тодорхойлно. 

Прекалликрейн идэвхжүүлэгч (ПКИ) тодорхойлох: Урвалын бичил самбарын А эгнээнд ПКИ-ийн шингэрүүлсэн стандарт болон шингэрүүлсэн шинжлэх сорьцоос 25 мкл хийж, дээр нь 50 мкл Прекалликрейны уусмал нэмж, холиод таглана.
Урвалын бичил самбарын В эгнээнд ПКИ-ийн шингэрүүлсэн стандарт болон шингэрүүлсэн шинжлэх сорьцоос 25 мкл хийж, дээр нь 50 мкл А буфер нэмж, таглана. Зөөлөн холиод 37оС-д ойролцоогоор 45 мин инкубаци хийнэ. Инкубацын хугацаа дуусмагц самбарыг авч, шингэрүүлсэн калликрейн субстратаас 100 мкл нэмнэ. 5 минут инкубац хийж, 50 мкл BABR-аас нэмнэ. СФМ-ийн 405 нм долгионы уртад гэрлийн шингээлтийг хэмжинэ. 

Ариун чанарын тодорхойлох: Эхлэл материал, завсрын бүтээгдэхүүн, бэлэн бүтээгдэхүүнээс авсан дээжинд 1:10 харьцаагаар Thioglycollate broth болон Soya bean casein digest broth тэжээлт орчнуудад тус тус тарилга хийнэ. Тарилга хийсэн Thioglycollate broth тэжээлт орчныг термостатын 30-350С хэмд 14 хоног өсгөвөрлөж үр дүнг тооцно. Тарилга хийсэн Soya bean casein digest broth тэжээлт орчныг термостатын 20-250С хэмд 14 хоног өсгөвөрлөж үр дүнг тооцно.

Хорон чанар тодорхойлох: Туршилтанд таван хулгана сонгон авч, урьдчилан бэлтгэсэн шинжилгээний дээжийг 0.5 мл тунгаар тооцон хэвлийн хөндийн арьсан дор 0.1мл/сек хурдтайгаар тарина. Урьдчилан бэлтгэсэн дээжийг тарьснаас хойш 48 цагийн дотор бүгд амьд байх ёстой. 48 цагийн дотор нэг, түүнээс дээш хулгана үхсэн тохиолдолд дахин 10 хулгана шинээр авч шинжилгээг давтан хийнэ. Давтан шинжилгээгээр 48 цагийн дотор нэг ч хулгана үхэхгүй байх ёстой.  

Халууруулах чанар: Шинжилгээний дээжийг термостатанд 380С болтол бүлээсгэнэ. Дээжийг туршилтын гурван туулайн чихний хураагуур судсанд аажим тарина. Дараа нь туулай бүрийн биеийн температурыг 1, 2, 3 цагийн зайтайгаар хэмжинэ. Хяналтын нэг туулайн биеийн температур 0.60С -ээс дээш, гурван туулайн биеийн температурын нийлбэр нь 1.40С-ээс дээш нэмэгдсэн тохиолдолд шинжилгээг давтан дахин таван туулайнд хийнэ. Гурван туулайн биеийн температурын өсөлтийн нийлбэр нь 1.40С, түүнээс бага байвал тарилгын эмийг халууруулах чанаргүй гэж тооцно. Харин гурван туулайн биеийн температурын өсөлтийн нийлбэр нь 1.50С-2.20С тохиолдолд шинээр таван туулайнд тарих ба биеийн температурын өсөлтийн нийлбэр нь туршилтын бүх найман туулайнд 3.80С -ээс бага байвал шинжилж буй эмийн бэлдмэл нь халууруулах чанаргүй гэж үзнэ.

Судалгааны үр дүн
К сийвэнгийн үйлдвэрлэлийн фракцын төгсгөлд 2480 гр тунадас гарсан. Тунадасаа 0.85% NaCl ариутгасан уусмалаар уургийн хэмжээг 10% болгон тохируулан найруулсан. Тунгалагжуулах болон ариун шүүлт хийсний дараагаар 1.5 мл, 3000 флакон иммуноглобулин гарган авсан. Хөлдөөсөн шинэ сийвэнгээс 2120 гр тунадас гарсан. Уургийн тохируулан найруулж, тунгалагжуулах болон ариун шүүлт хийсний дараа 1.5 мл 10% 3378 флакон иммуноглобулины бэлэн бүтээгдэхүүн гарган авсан (Зураг 3).   
 

К сийвэн болон хөлдөөсөн шинэ сийвэнгийн иммуноглобулины бэлэн бүтээгдэхүүнд чанарын хяналтын шинжилгээг хийхэд ариун чанартай, хорон болон халууруулах чанаргүй, гадаад байдал, өнгө, үнэр, иммунологи, биохимийн үзүүлэлтүүд шаардлагад нийцэж байсан (Хүснэгт 2). Уургийн цэвэршилтийн хэмжээ хоёр түүхий эдэд ижил 99.7% буюу өндөр хэмжээтэй байв. 

 
Шинжилгээний дүнгээс үзэхэд, К сийвэн болон хөлдөөсөн шинэ сийвэн нь  шинжилгээний үр дүн, бүтээгдэхүүний гарцын хэмжээгээрээ ойролцоо байв. Мөн хепатит В, С, ХДХВ, тэмбүү өвчнийг үүсгэгч вирусын эсрэгбие илрээгүй ба цусны бүлэгнэлт үүсгэгч прекалликрейн идэвхжүүлэгчийн хэмжээ бага байгаагаас харахад бүтээгдэхүүнийг хэрэглээнд нэвтрүүлэхэд аюулгүй байдлыг бүрэн хангаж байна. Харин түүхий эд болон бүтээгдэхүүн үйлдвэрлэх зардлын хувьд К сийвэн нь хөлдөөсөн шинэ сийвэнгээс 3 дахин хямд байснаараа ялгаатай байв.

Дүгнэлт
К сийвэн болон хөлдөөсөн шинэ сийвэнгээс эцсийн бүтээгдэхүүний шаардлага хангасан, уургийн цэвэршилт өндөртэй, эмчилгээний өндөр идэвхтэй бүтээгдэхүүнүүдийг гарган авлаа. Эдгээр түүхий эдийг иммуноглобулины үйлдвэрлэлд ашиглахад бүрэн боломжтой байсан тул эдийн засгийн зардлыг тооцоон К сийвэнг үйлдвэрлэлд сонгон ашиглах нь зүйтэй байна. 
 
Ном зүй
1.    Монгол улсын үндэсний фармакопей. Улаанбаатар; 2011
2.    МУ-ын Засгийн газрын 144 дүгээр тогтоол; 2021
3.    Б.Номин, Т.Халиунаа, Л.Алтантуяа, Б.Анхмаа, Ж.Оюунбилэг, Б.Ичинхорлоо, Б.Сайнчимэг. Хроматографийн аргаар уургийн бэлдмэлүүд үйлдвэрлэх технологи нутагшуулах инновацийн төсөл. Улаанбаатар; 2017-2019
4.    Л.Алтантуяа, Ж.Оюунбилэг, Б.Ичинхорлоо, Б.Сайнчимэг. Цус, цусны бүтээгдэхүүний аюулгүй байдлыг хангах, хүрэлцээтэй, тогтвортой хангамжийг бүрдүүлэх арга технологи. Улаанбаатар; 2006-2008
5.    Barbe, F, et al. Early detection of antibodies to HIV-1 by third generation enzyme immunoassay. Ann. Biol. Clin 1992; (52):341-345
6.    Cohn, E, J., Strong, L, E., Hughes, J, W., Mulford, D, J., Ashworth, J, N., Melin,  M., Taylor, H, L. Preparation and properties of serum and plasma proteins. IV. A system for the separation into fractions of the protein and lipoprotein components of biological tissue and fluids. Journal of the American Chemical Society 2006(68): 459- 475
 

Судалгааны ажлыг нийтлэх санал өгсөн: Химийн ухааны 
доктор И.Туяажаргал